Baggrund
Melanotan I, også kendt som Afamelanotide, er et lineært polypeptid sammensat af 13 aminosyrer, der er klar til at spille en stadig vigtigere rolle i farmaceutisk forskning. De primære engelske navne for Melanotan I er Melanotan-1 og Afamelanotide. Som en syntetisk analog af α-melanocyt-stimulerende hormon α-MSH) kan Melanotan I bruges til at behandle lysfølsomhedsforstyrrelser forårsaget af erytropoietisk protoporfyri. I øjeblikket er de fleste Melanotan I-produkter kun mærket til forskningsbrug og er endnu ikke beregnet til human anvendelse. I traditionel fastfasesyntese påvirker valget af harpiks væsentligt koblingseffektiviteten og produktets endelige renhed.
Grundlæggende oplysninger
Kinesisk navn: Melanotan 1
Engelsk navn: Melanotan-1
Firmanr.: GT-A006
CAS-nr.: 75921-69-6
Sekvens: SYS{Ne}EH{D-Phe}RWGKPV-NH2
Molekylformel: C78H111N21O19
Molekylvægt: 1646,88
Fremstillingsmetode
JEG. Fremstilling af Fmoc-Val-Amino Resin
Trin 1:Vej 11,11 g (5 mmol) Ramage Amide AM-harpiks med en substitutionsgrad på 0,45 mmol/g og tilsæt det til en fastfasereaktor. Tilsæt DCM for at kvælde harpiksen i 30 minutter, og dræn derefter. Vask tre gange med DMF. Tilsæt en DMF-opløsning indeholdende 20% piperidin (v/v) og omsæt i 5 minutter. Tilsæt yderligere 20% piperidin DMF-opløsning og omsæt i 10 minutter med en DMF-vask imellem. Efter at reaktionen er fuldført, drænes og vaskes tre gange med DMF.
Trin 2:Opløs 5,09 g Fmoc-Val-OH, 2,02 g HOBT (1-hydroxybenzotriazol) og 2,32 ml DIC (N,N'-diisopropylcarbodiimid) i DMF ved 0°C. Efter fuldstændig opløsning tilsættes blandingen til reaktionssøjlen og omsættes ved stuetemperatur i 1 time. Overvåg reaktionsforløbet ved hjælp af ninhydrin-testen, og sørg for et negativt resultat. Efter at reaktionen er fuldført, vaskes tre gange med DMF for at opnå Fmoc-Val-aminoharpiks.
II. Fremstilling af fuldt beskyttet harpikspeptid af Melanotan I.
Trin 1:Tilsæt 20% piperidin i DMF-opløsning (volumenforhold) til ovenstående Fmoc-Val-aminoresin. Reager i 5 minutter, tilsæt derefter endnu en portion 20% piperidin i DMF-opløsning og omsæt i 10 minutter. Vask én gang med DMF i intervallet. Efter at reaktionen er afsluttet, tørres under vakuum og vaskes tre gange med DMF.
Trin 2:Opløs 5,06 g Fmoc-Pro-OH, 2,02 g HOBT (1-hydroxybenzotriazol) og 2,32 ml DIC (N,N'-diisopropylcarbodiimid) i DMF ved 0°C. Efter fuldstændig opløsning tilsættes blandingen til reaktionssøjlen og omsættes ved stuetemperatur i 1 time. Overvåg reaktionsforløbet ved hjælp af ninhydrin-testen (Kaiser-test), indtil negative resultater opnås. Efter afslutning vaskes tre gange med DMF for at opnå Fmoc-Pro-Val-aminoresin.
Trin 3:Følg metoden beskrevet i trin 2, sekventielt koble hver aminosyre i henhold til sekvensen af Melanotan I. Efter afslutning af Ac-Ser(tBu)-OH-koblingsreaktionen vaskes tre gange med DMF, tre gange med DCM (dichlormethan) og tre gange med methanol. Tør under vakuum for at opnå 23,89 g fuldt beskyttet Melanotan I harpiksbundet peptid.
III. Fremstilling af melanotan I rå peptid
23,89 g fuldt beskyttet Melanotan I-harpiksbundet peptid blev anbragt i en rundbundet kolbe. Ved 0°C blev 250 ml af en forudfremstillet spaltningscocktail (sammensat af TFA:thioanisol:phenol:triisopropylsilan:vand = 82,5:7,5:5:3:2 efter volumen) langsomt tilsat under omrøring. Blandingen blev omsat ved lav temperatur i 0,5 timer efterfulgt af reaktion ved stuetemperatur i 2 timer. Spaltningsopløsningen blev derefter filtreret under vakuum. Denne opløsning blev langsomt tilsat til 2 L iskold vandfri diethylether under omrøring. Det rå peptid blev isoleret ved filtrering, vasket tre gange med iskold diethylether, og 8,55 g Melanotan I rå peptid blev opnået.
IV. Fremstilling af Melanotan I oprenset peptid
Trin 1:Opløs det rå Melanotan I-peptid i 100 ml renset vand og filtrer gennem en 0,45 μm membran for at opnå en rå peptidopløsning.
Trin 2:Rens det rå Melanotan I-peptid ved hjælp af højtydende væskekromatografi (HPLC). Brug en DAC-HB50 dynamisk aksial kompressionssøjle med mobil fase A (0,05% trifluoreddikesyre vandig opløsning) og mobil fase B (0,05% trifluoreddikesyre i acetonitril). Udfør gradienteluering til separation og oprensning. Påvis prøven ved hjælp af en UV-detektor og opsaml peptidopløsningen svarende til måltoppen i fraktioner.
Trin 3:Efter HPLC-rensning opnås 180 ml Melanotan I-trifluoracetatopløsning med en renhed på over 99 %. Koncentrer opløsningen til 50 ml ved rotationsinddampning.
Trin 4:Udlign kromatografisøjlen med deioniseret vand og påfyld 50 ml af den rensede Melanotan I-trifluoracetatopløsning (renhed >99%). Eluer i 50 minutter i et 2 % eddikesyreopløsningssystem. Koncentrer det opsamlede målprodukt til 80 ml via rotationsfordampning. Udfør forfrysetørring og frysetørring for i sidste ende at opnå 5,33 g Melanotan I-oprenset peptid med et udbytte på 32,33%.
Posttid: 2026-01-05