Arbejdsprincippet og fremstillingen af ​​Limulus-reagens-tripeptid/endotoksin-substratet

Limulus-reagens-tripeptidet er et tripeptidstof med en specifik sekvens ekstraheret fra hesteskokrabbeblodcellelysat eller kunstigt syntetiseret. Limulus-reagens-tripeptidet er et kromogent substrat, der bruges til kvantitativ analyse (såsom den bakterielle endotoksintest) til at detektere og måle komponenterne i Gram-negative bakterier—endotoksiner. Når den påvirkes af enzymer aktiveret af endotoksiner, frigives en farvet forbindelse (såsom p-nitroanilin), hvilket gør det muligt at måle farveintensiteten og korrelere med endotoksinindholdet.

Arbejdsprincip

Endotoksinaktivering: Ved tilstedeværelse af endotoksiner frigiver amebocytter i hesteskokrabbeblodet enzymer og udløser derved koagulationskaskaden.

Enzymvirkning: Det aktiverede enzym (normalt koagulerende enzym) virker derefter på et kromogent substrat.

Chromogen reaktion: Enzymet spalter substratet og frigiver en gul forbindelse kaldet p-nitroanilin (pNA).

Kvantitativ analyse: Intensiteten af ​​den gule farve er proportional med endotoksinindholdet i prøven og måles sædvanligvis ved hjælp af et spektrofotometer ved en absorbans på 405 nm.

Fremstillingsmetoder

Limulus-reagens-tripeptidet kan opnås gennem to fremgangsmåder med hensyn til fremstilling.

1. Udvinding af naturlige komponenter fra Limulus-blodceller og opnåelse af det aktive tripeptid gennem separation og oprensning.

2. Anvendelse af fastfase-synteseteknologi til sekventielt at forbinde specifikke aminosyresekvenser, præcist at kontrollere tripeptidets struktur.

På grund af bevaringspolitikkerne for Limulus (med provinser som Zhejiang, Fujian, Guangdong og Guangxi angiver det som et "provinsielt nøglebeskyttet akvatisk dyreliv" / udstedte Hongkong regler i slutningen af ​​2012, der forbyder bundtrawl), og fordi udvindingsprocessen er kompleks og udfordrende, er prisen på den første metode relativt høj. Derfor er fastfasesyntese nu almindeligt anvendt. Ved sekventielt at forbinde specifikke aminosyresekvenser kan tripeptidets struktur styres præcist. Denne metode sikrer ikke kun produktets stabilitet og konsistens, men muliggør også produktion i stor skala, der opfylder den farmaceutiske industris behov for test af reagenser.