Peptider er en klasse af forbindelser dannet ved at forbinde flere aminosyrer gennem peptidbindinger.De er allestedsnærværende i levende organismer.Indtil nu er titusindvis af peptider blevet fundet i levende organismer.Peptider spiller en vigtig rolle i reguleringen af de funktionelle aktiviteter i forskellige systemer, organer, væv og celler og i livsaktiviteter og bruges ofte i funktionel analyse, antistofforskning, lægemiddeludvikling og andre områder.Med udviklingen af bioteknologi og peptidsynteseteknologi er flere og flere peptidlægemidler blevet udviklet og anvendt i klinikken.
Der er en lang række peptidmodifikationer, som ganske enkelt kan opdeles i postmodifikation og procesmodifikation (ved hjælp af afledt aminosyremodifikation) og N-terminal modifikation, C-terminal modifikation, sidekædemodifikation, aminosyremodifikation, skeletmodifikation, osv., afhængigt af modifikationsstedet (figur 1).Som et vigtigt middel til at ændre hovedkædestrukturen eller sidekædegrupper af peptidkæder kan peptidmodifikation effektivt ændre de fysiske og kemiske egenskaber af peptidforbindelser, øge vandopløseligheden, forlænge virkningstiden in vivo, ændre deres biologiske fordeling, eliminere immunogenicitet , reducere toksiske bivirkninger osv. I dette papir introduceres flere vigtige peptidmodifikationsstrategier og deres karakteristika.
1. Cykling
Cykliske peptider har mange anvendelser inden for biomedicin, og mange naturlige peptider med biologisk aktivitet er cykliske peptider.Fordi cykliske peptider har tendens til at være mere stive end lineære peptider, er de ekstremt modstandsdygtige over for fordøjelsessystemet, kan overleve i fordøjelseskanalen og udviser en stærkere affinitet for målreceptorer.Cyclisering er den mest direkte måde at syntetisere cykliske peptider på, især for peptider med stort strukturelt skelet.I henhold til cykliseringstilstanden kan den opdeles i sidekæde-sidekædetype, terminal - sidekædetype, terminal - terminaltype (ende-til-ende-type).
(1) sidekæde-til-sidekæde
Den mest almindelige type sidekæde til sidekæde-cyklisering er disulfidbro mellem cysteinrester.Denne ringslutning indføres ved, at et par cysteinrester afbeskyttes og derefter oxideres til dannelse af disulfidbindinger.Polycyklisk syntese kan opnås ved selektiv fjernelse af sulfhydrylbeskyttelsesgrupper.Ringslutning kan udføres enten i et post-dissociationsopløsningsmiddel eller på en præ-dissociationsharpiks.Ringslutning på harpikser kan være mindre effektiv end ringslutning med opløsningsmiddel, fordi peptiderne på harpikser ikke let danner ringsluttede konformationer.En anden type sidekæde-sidekæde-cyklisering er dannelsen af en amidstruktur mellem en asparaginsyre- eller glutaminsyrerest og baseaminosyren, hvilket kræver, at sidekædebeskyttelsesgruppen skal kunne fjernes selektivt fra polypeptidet enten på harpiksen eller efter dissociation.Den tredje type sidekæde-sidekæde ringslutning er dannelsen af diphenylethere med tyrosin eller p-hydroxyphenylglycin.Denne form for ringdannelse i naturlige produkter findes kun i mikrobielle produkter, og cykliseringsprodukter har ofte potentiel medicinsk værdi.Fremstillingen af disse forbindelser kræver unikke reaktionsbetingelser, så de bruges ikke ofte i syntesen af konventionelle peptider.
(2) terminal-til-sidekæde
Terminal-sidekæde-cyklisering involverer sædvanligvis C-terminalen med aminogruppen i lysin- eller ornithin-sidekæden eller N-terminalen med asparaginsyre- eller glutaminsyre-sidekæden.Anden polypeptid-cyklisering foretages ved at danne etherbindinger mellem terminal C og serin- eller threonin-sidekæder.
(3) Terminal eller head-to-tail type
Kædepolypeptider kan enten cykles i et opløsningsmiddel eller fikseres på en harpiks ved sidekædecyklering.Lave koncentrationer af peptider bør anvendes i opløsningsmiddelcentralisering for at undgå oligomerisering af peptider.Udbyttet af et hoved-til-hale syntetisk ringpolypeptid afhænger af sekvensen af kædepolypeptidet.Derfor bør der, før der fremstilles cykliske peptider i stor skala, først oprettes et bibliotek af mulige kædede blypeptider, efterfulgt af ringslutning for at finde sekvensen med de bedste resultater.
2. N-methylering
N-methylering forekommer oprindeligt i naturlige peptider og introduceres i peptidsyntese for at forhindre dannelsen af hydrogenbindinger og derved gøre peptider mere modstandsdygtige over for bionedbrydning og clearance.Syntese af peptider ved hjælp af N-methylerede aminosyrederivater er den vigtigste metode.Derudover kan Mitsunobu-reaktion af N-(2-nitrobenzensulfonylchlorid) polypeptid-harpiksmellemprodukter med methanol også anvendes.Denne metode er blevet brugt til at fremstille cykliske peptidbiblioteker indeholdende N-methylerede aminosyrer.
3. Fosforylering
Fosforylering er en af de mest almindelige post-translationelle modifikationer i naturen.I humane celler er mere end 30 % af proteinerne fosforyleret.Fosforylering, især reversibel phosphorylering, spiller en vigtig rolle i at kontrollere mange cellulære processer, såsom signaltransduktion, genekspression, cellecyklus og cytoskeletregulering og apoptose.
Fosforylering kan observeres ved en række aminosyrerester, men de mest almindelige phosphoryleringsmål er serin-, threonin- og tyrosinrester.Phosphotyrosin-, phosphothreonin- og phosphoserinderivater kan enten indføres i peptider under syntese eller dannes efter peptidsyntese.Selektiv phosphorylering kan opnås ved at bruge rester af serin, threonin og tyrosin, der selektivt fjerner beskyttelsesgrupper.Nogle phosphoryleringsreagenser kan også indføre phosphorsyregrupper i polypeptidet ved postmodifikation.I de senere år er stedspecifik phosphorylering af lysin blevet opnået ved hjælp af en kemisk selektiv Staudinger-phosphitreaktion (figur 3).
4. Myristoylering og palmitoylering
Acylering af N-terminalen med fedtsyrer tillader peptider eller proteiner at binde til cellemembraner.Den myridamoylerede sekvens på N-terminalen gør det muligt for Src-familiens proteinkinaser og revers transkriptase Gaq-proteiner at blive målrettet til at binde til cellemembraner.Myristinsyre blev bundet til N-terminalen af resin-polypeptidet under anvendelse af standardkoblingsreaktioner, og det resulterende lipopeptid kunne dissocieres under standardbetingelser og oprenses ved RP-HPLC.
5. Glykosylering
Glycopeptider som vancomycin og teicolanin er vigtige antibiotika til behandling af lægemiddelresistente bakterieinfektioner, og andre glycopeptider bruges ofte til at stimulere immunsystemet.Da mange mikrobielle antigener er glycosylerede, er det desuden af stor betydning at studere glycopeptider for at forbedre den terapeutiske virkning af infektion.På den anden side har det vist sig, at proteinerne på tumorcellers cellemembran udviser unormal glykosylering, hvilket gør, at glycopeptider spiller en vigtig rolle i cancer- og tumorimmunforsvarsforskning.Glycopeptider fremstilles ved Fmoc/t-Bu-metoden.Glykosylerede rester, såsom threonin og serin, indføres ofte i polypeptider af pentafluorphenolester-aktiverede fMOC'er for at beskytte glycosylerede aminosyrer.
6. Isopren
Isopentadienylering forekommer på cysteinrester i sidekæden nær C-terminalen.Protein isopren kan forbedre cellemembranaffinitet og danne protein-protein interaktion.Isopentadienerede proteiner inkluderer tyrosinphosphatase, lille GTase, cochaperonmolekyler, nuklear lamina og centromere bindingsproteiner.Isoprenpolypeptider kan fremstilles under anvendelse af isopren på harpikser eller ved at introducere cysteinderivater.
7. Modifikation af polyethylenglycol (PEG).
PEG-modifikation kan bruges til at forbedre proteinhydrolytisk stabilitet, biofordeling og peptidopløselighed.Introduktionen af PEG-kæder til peptider kan forbedre deres farmakologiske egenskaber og også hæmme hydrolysen af peptider med proteolytiske enzymer.PEG-peptider passerer lettere gennem det glomerulære kapillære tværsnit end almindelige peptider, hvilket i høj grad reducerer renal clearance.På grund af den forlængede aktive halveringstid af PEG-peptider in vivo, kan det normale behandlingsniveau opretholdes med lavere doser og mindre hyppige peptidlægemidler.PEG-modifikation har dog også negative effekter.Store mængder PEG forhindrer enzymet i at nedbryde peptidet og reducerer også peptidets binding til målreceptoren.Men PEG-peptiders lave affinitet opvejes normalt af deres længere farmakokinetiske halveringstid, og ved at være til stede i kroppen længere, har PEG-peptider større sandsynlighed for at blive absorberet i målvæv.Derfor bør PEG-polymerspecifikationer optimeres for optimale resultater.På den anden side ophobes PEG-peptider i leveren på grund af nedsat renal clearance, hvilket resulterer i makromolekylært syndrom.Derfor skal PEG-modifikationer designes mere omhyggeligt, når peptider bruges til lægemiddeltestning.
Almindelige modifikationsgrupper af PEG-modifikatorer kan groft opsummeres som følger: Amino (-amin) -NH2, aminomethyl-Ch2-NH2, hydroxy-OH, carboxy-Cooh, sulfhydryl (-Thiol) -SH, Maleimid -MAL, succinimidcarbonat - SC, succinimidacetat -SCM, succinimidpropionat -SPA, n-hydroxysuccinimid -NHS, Acrylate-ch2ch2cooh, aldehyd -CHO (såsom propional-ald, butyrALD), akrylbase (-acrylat-acrl), azido-azid, biotinyl- Biotin, Fluorescein, glutaryl-GA, acrylathydrazid, alkyn-alkyn, p-toluensulfonat-OT'er, succinimidsuccinat -SS osv. PEG-derivater med carboxylsyrer kan kobles til n-terminale aminer eller lysinsidekæder.Aminoaktiveret PEG kan kobles til asparaginsyre- eller glutaminsyresidekæder.Mal-aktiveret PEG kan konjugeres til mercaptan af fuldt afbeskyttede cysteinsidekæder [11].PEG-modifikatorer klassificeres almindeligvis som følger (bemærk: mPEG er methoxy-PEG, CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH):
(1) ligekædet PEG-modifikator
mPEG-SC, mPEG-SCM, mPEG-SPA, mPEG-OTs, mPEG-SH, mPEG-ALD, mPEG-butyrALD, mPEG-SS
(2) bifunktionel PEG-modifikator
HCOO-PEG-COOH, NH2-PEG-NH2, OH-PEG-COOH, OH-PEG-NH2, HCl·NH2-PEG-COOH, MAL-PEG-NHS
(3) forgrenende PEG-modifikator
(mPEG)2-NHS, (mPEG)2-ALD, (mPEG)2-NH2, (mPEG)2-MAL
8. Biotinisering
Biotin kan bindes stærkt med avidin eller streptavidin, og bindingsstyrken er endda tæt på kovalent binding.Biotin-mærkede peptider er almindeligt anvendt i immunoassay, histocytokemi og fluorescensbaseret flowcytometri.Mærkede antibiotinantistoffer kan også bruges til at binde biotinylerede peptider.Biotinmærker er ofte knyttet til lysinsidekæden eller N-terminalen.6-aminocapronsyre bruges ofte som en binding mellem peptider og biotin.Bindingen er fleksibel i binding til substratet og binder bedre i nærvær af sterisk hindring.
9. Fluorescerende mærkning
Fluorescerende mærkning kan bruges til at spore polypeptider i levende celler og til at studere enzymer og virkningsmekanismer.Tryptofan (Trp) er fluorescerende, så det kan bruges til iboende mærkning.Emissionsspektret af tryptophan afhænger af det perifere miljø og falder med faldende opløsningsmiddelpolaritet, en egenskab, der er nyttig til påvisning af peptidstruktur og receptorbinding.Tryptophanfluorescens kan slukkes med protoneret asparaginsyre og glutaminsyre, hvilket kan begrænse dets anvendelse.Dansylchloridgruppen (Dansyl) er meget fluorescerende, når den er bundet til en aminogruppe og bruges ofte som et fluorescerende mærke for aminosyrer eller proteiner.
Fluorescensresonans Energikonvertering (FRET) er nyttig til enzymundersøgelser.Når FRET påføres, indeholder substratpolypeptidet sædvanligvis en fluorescensmærkende gruppe og en fluorescensdæmpende gruppe.Mærkede fluorescerende grupper slukkes af quencheren gennem ikke-foton energioverførsel.Når peptidet er dissocieret fra det pågældende enzym, udsender mærkningsgruppen fluorescens.
10. Burpolypeptider
Burpeptider har optisk fjernbare beskyttende grupper, der beskytter peptidet mod binding til receptoren.Når det udsættes for UV-stråling, aktiveres peptidet, hvilket genopretter dets affinitet til receptoren.Fordi denne optiske aktivering kan styres i henhold til tid, amplitude eller placering, kan burpeptider bruges til at studere reaktioner, der forekommer i celler.De mest almindeligt anvendte beskyttelsesgrupper til burpolypeptider er 2-nitrobenzylgrupper og deres derivater, som kan introduceres i peptidsyntese via beskyttende aminosyrederivater.Aminosyrederivater, der er blevet udviklet, er lysin, cystein, serin og tyrosin.Aspartat- og glutamatderivater er imidlertid ikke almindeligt anvendte på grund af deres modtagelighed for cyklisering under peptidsyntese og dissociation.
11. Polyantigen peptid (MAP)
Korte peptider er normalt ikke immune og skal kobles til bærerproteiner for at producere antistoffer.Polyantigen peptid (MAP) er sammensat af flere identiske peptider forbundet til lysinkerner, som specifikt kan udtrykke højpotente immunogener og kan bruges til at fremstille peptid-bærerprotein-couplets.MAP-polypeptider kan syntetiseres ved fastfasesyntese på MAP-harpiks.Ufuldstændig kobling resulterer imidlertid i manglende eller trunkerede peptidkæder på nogle grene og udviser således ikke egenskaberne af det originale MAP-polypeptid.Som et alternativ kan peptider fremstilles og oprenses separat og derefter kobles til MAP.Peptidsekvensen knyttet til peptidkernen er veldefineret og let karakteriseret ved massespektrometri.
Konklusion
Peptidmodifikation er et vigtigt middel til at designe peptider.Kemisk modificerede peptider kan ikke kun opretholde høj biologisk aktivitet, men også effektivt undgå ulemperne ved immunogenicitet og toksicitet.Samtidig kan kemisk modifikation give peptider nogle nye fremragende egenskaber.I de senere år er fremgangsmåden til CH-aktivering til post-modifikation af polypeptider blevet udviklet hurtigt, og mange vigtige resultater er blevet opnået.
Indlægstid: 20-03-2023