Fluorescensresonansenergioverførsel (FRET)
Fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) er en ikke-strålende energioverførselsproces, hvor donorens ophidsede tilstandsenergi overføres til acceptorens ophidsede tilstand gennem interaktion mellem intermolekylære elektriske par. Denne proces involverer ikke fotoner og er derfor ikke-strålende. Dette assay har fordelene ved at være hurtig, følsom og enkel.
Farvestoffet, der anvendes i FRET -assayet, kan være identisk. Men i de fleste applikationer bruges forskellige farvestoffer faktisk. Kort fortalt er overførslen af lysende resonansenergi overførslen af et par dipoler fra donoren (farvestof 1) til acceptoren (farvestof 2), når donorgruppen er ophidset. Generelt overlapper emissionsspektret for donorfluorophore -gruppen med absorptionsspektret for acceptorgruppen. ”Når afstanden mellem de to fluoroforer er passende (10 - 100 a), kan overførslen af fluoroforenergi fra donoren til acceptoren observeres.” Metoden til energioverførsel afhænger af den kemiske struktur af receptoren:
1. konverteres til molekylær vibration, det vil sige det lysende lys af energioverførsel forsvinder. (Receptoren er en let slukker)
2. Emissionen er mere intens end selve receptoren, hvilket resulterer i en rødskift i det sekundære fluorescensspektrum. ” (Receptorer er lysende emittere).
Donorgruppen (EDANS) og Acceptorgen (DABCYL) er ensartet knyttet til det naturlige substrat af HIV -protease, og når underlaget ikke er frakoblet, kan Dabcyl Quenle Edans og derefter blive uopdagelig for fluor. Ved HIV-1-protease-afbrydelse slukkes EDANS ikke længere af DABCYL, og EDANS LUCIFERASES kan efterfølgende påvises. Tilgængeligheden af proteaseinhibitorer kan overvåges ved ændringer i fluorescensintensiteten af Edans.
FRET -peptider er praktiske værktøjer til at studere peptidase -ikke -specificitet. Da dens reaktionsproces kan overvåges kontinuerligt, tilvejebringer den en praktisk metode til påvisning af enzymaktivitet. Sheenen produceret efter hydrolyse af peptidbindinger af donoren/acceptoren giver et mål for enzymaktivitet ved nanomolære koncentrationer. Når FRET -peptidet er intakt, viser det en pludselig forsvinden af den interne flash, men når ethvert peptidbinding overfor donoren/acceptor bryder, frigiver det en flash, som kan detekteres kontinuerligt, og enzymaktiviteten kan derefter kvantificeres.
Posttid: 2025-07-02