Fluorescensresonansenergioverførsel (FRET)
Fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) er en ikke-strålingsenergioverførselsproces, hvor donorens exciterede tilstandsenergi overføres til den acceptorexciterede tilstand gennem interaktionen af intermolekylære elektriske par.Denne proces involverer ikke fotoner og er derfor ikke-strålende.Denne analyse har fordelene ved at være hurtig, følsom og enkel.
Farvestoffet, der anvendes i FRET-analysen, kan være identisk.Men i de fleste applikationer bruges der faktisk forskellige farvestoffer.Kort fortalt er overførslen af lysresonansenergi overførslen af et par dipoler fra donoren (farvestof 1) til acceptoren (farvestof 2), når donorgruppen er exciteret.Generelt overlapper emissionsspektret for donorfluoroforgruppen med absorptionsspektret for Acceptorgruppen."Når afstanden mellem de to fluoroforer er passende (10 - 100 A), kan overførslen af fluoroforenergi fra donor til acceptor observeres."Metoden til energioverførsel afhænger af receptorens kemiske struktur:
1. Omdannes til molekylær vibration, det vil sige, at det lysende lys af energioverførsel forsvinder.(Receptoren er en lysdæmper)
2. Emissionen er mere intens end selve receptoren, hvilket resulterer i en rødforskydning i det sekundære fluorescensspektrum."(Receptorer er lysgivere).
Donorgruppen (EDANS) og acceptorgenet (DABCYL) er ensartet knyttet til det naturlige substrat for HIV-protease, og når substratet ikke er afbrudt, kan DABCYL dæmpe EDANS og derefter blive upåviselig for fluor.Ved afbrydelse af HIV-1-protease slukkes EDANS ikke længere af DABCYL, og EDANS-luciferaser kan efterfølgende påvises.Tilgængeligheden af proteaseinhibitorer kan overvåges ved ændringer i fluorescensintensiteten af EDANS.
FRET-peptider er praktiske værktøjer til at studere peptidase-nonspecificitet.Da dets reaktionsproces kan overvåges kontinuerligt, giver det en bekvem metode til påvisning af enzymaktivitet.Glansen produceret efter hydrolysen af peptidbindinger af donoren/acceptoren giver et mål for enzymaktivitet ved nanomolære koncentrationer.Når FRET-peptidet er intakt, viser det en pludselig forsvinden af den interne flash, men når en hvilken som helst peptidbinding modsat donoren/acceptoren brydes, frigiver det et flash, som kan detekteres kontinuerligt, og enzymaktiviteten kan derefter kvantificeres.
Indlægstid: 14. august 2023